以泰國T.W.Flegel教授以及臺灣羅竹芳教授為首的研究人員已經(jīng)公開確定引起急性肝胰腺壞死?。╤epatopancreatic necrosis disease，AHPND）的那株特異性副溶血性弧菌的PCR快速檢測的方法，并且公布了檢測方法的PCR引物以及反應(yīng)方法。

　　前言：

　　在泰國，實驗由Centex Shrimp (泰國瑪希隆大學(xué)杰出人才中心對蝦研究組)、瑪希隆大學(xué)公共衛(wèi)生部和水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)研究中心部、水產(chǎn)科學(xué)研究院、農(nóng)業(yè)大學(xué)等多名研究人員完成的。自2011以來，這項工作得到了農(nóng)業(yè)研究發(fā)展機構(gòu)、臺灣國家科學(xué)委員會等多個機構(gòu)的資金支持。

　　2013年12月5日，研究人員通過獲得的基因序列的對比信息，參照對比信息可以測試不同的PCR檢測方法，他們花了近20天的時間來驗證不同的PCR檢測，并公布了他們認為最好的檢測方式。

PCR  操作：

　　預(yù)熱 : 94°C, 5min

　　PCR 25~30 cycles with：

　　變性 : 94°C, 30 sec

　　退火 : 60°C, 30 sec　

　　延伸 : 72°C, 60 sec　

　　后延伸 : 72°C, 10 min

　　擴增產(chǎn)物  : ~700 bp

　　AHPND 引物組1 (AP1)　

　　AP1F：- 5’- CCTTGGGTGTGCTTAGAGGATG -3’　　

　　AP1R：- 5’- GCAAACTATCGCGCAGAACACC -3’　

　　AP1擴增產(chǎn)物為700 bp

　　AHPND 引物組2 (AP2)　　

　　AP2F：- 5’- TCACCCGAATGCTCGCTTGTGG -3’　

　　AP2R：- 5’- CGTCGCTACTGTCTAGCTGAAG -3’

　　AP2擴增產(chǎn)物為700 bp

正文如下：

　　目前，養(yǎng)蝦業(yè)在亞洲的經(jīng)濟局勢非常嚴峻，由對蝦死亡和停止養(yǎng)蝦造成的經(jīng)濟損失非常大。我們相信及時公布檢測方法，降低AHPND暴發(fā)風(fēng)險的所獲得的收益，遠遠比從檢測產(chǎn)品中收到的專利費用以及我們研究所需要的費用要多。如果要申請專利，還需要推遲幾周甚至到幾個月的時間用來準備文件，以及準備足量的商業(yè)檢測試劑盒投入市場，以滿足市場需求。我們無法預(yù)測推遲幾天、幾周甚至幾個月里，將造成的潛在市場經(jīng)濟損失。

　　基于以上諸多因素，我們決定公開AHPND的PCR檢測操作方法，允許這些信息更為廣泛、迅速的傳播，以減少暴發(fā)AHPND的風(fēng)險。

　　雖然我們已經(jīng)做了大量測試，但由于樣本數(shù)還是有限的，簡單地說，我們發(fā)現(xiàn)以下幾個情況：

　　1、這兩對引物檢測了68個樣品，兩對引物檢測67個樣本的檢測結(jié)果是一致的。

　　2、從糧農(nóng)組織在越南用于研究宏基因組學(xué)分析收集的對蝦肝胰臟組織（每個池塘10蝦）的14個樣本中，其中8個樣品具有積極的AHPND病理特征，但PCR檢測結(jié)果顯示5個為陽性結(jié)果3個為陰性結(jié)果（兩對引物檢測顯示結(jié)果）;而5個樣品的AHPND病理特征不明顯的，兩對引物PCR檢測結(jié)果均為陰性結(jié)果。

　　3、68個測試樣本中分理出5株副溶血弧菌的AHPND樣本中，并通過生物鑒定都可以導(dǎo)致AHPND病變，其中有3個樣品是在2002年在對蝦底泥中分離得到的弧菌，并被證實并不會引起暴發(fā)AHPND（兩對引物檢測結(jié)果顯示呈陰性），另外2株在水體及蝦體取得的樣本，尚未進行生物測試。

　　4、有一個弧菌生物測定不會導(dǎo)致AHPND的組織病理，但是養(yǎng)殖過程中的卻造成高死亡率并伴隨著肝胰腺組織病變癥狀，兩對引物PCR檢測結(jié)果均為陽性。

　　5、新分離的瓦氏菌（Shewanella）、紅球菌（Rhodococcus）、賴氏細菌（Leifsonia）、戴爾福特菌（ Delftia）、青枯菌（Ralstonia）、創(chuàng)傷弧菌（V. vulnificus）、哈維氏弧菌（ V. harveyi）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）和枯草芽孢桿菌（B. subtilis）的兩對引物檢測結(jié)果為陰性。

　　至此，我們不能保證所闡述的方法與每個可能的非AHPND細菌的樣本或者其它有機體沒有交叉反應(yīng)。我們也不能保證這種方法能檢測出每一株可能引起對蝦AHPND的細菌。我們也邀請所有行業(yè)人員，幫助我們進行進一步的驗證、改進這個檢測方法。

　　我們初步的序列拼接和序列比較分析表明，我們已經(jīng)確定了的目標序列來自細菌的質(zhì)粒DNA并不是來自于AHPND菌株的染色體DNA。如果這個假設(shè)被證實，這也將影響AHPND有關(guān)的毒力傳導(dǎo)機制。然而確定毒素所需的時間目前還無法確定。由于情況緊急，我們決定發(fā)布PCR檢測引物序列信息，它將作為一個臨時檢測工具，直到毒素被確定。