酵母菌隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，應(yīng)用的范圍越來越廣泛，已經(jīng)滲透到飼料、醫(yī)療、食品、化妝等諸多領(lǐng)域，在養(yǎng)殖領(lǐng)域，酵母菌源產(chǎn)品具有改善腸道消化吸收、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、增強(qiáng)動(dòng)物免疫力和抗應(yīng)激力等作用，并且具有較強(qiáng)的誘食效果 ^[1-10]。隨著產(chǎn)業(yè)和加工技術(shù)的發(fā)展，相應(yīng)產(chǎn)生的酵母衍生物越來越多，當(dāng)種類繁雜的酵母源產(chǎn)品進(jìn)入市場(chǎng)時(shí)，消費(fèi)者只是根據(jù)產(chǎn)品簡(jiǎn)介了解酵母產(chǎn)品的作用，不能直觀地區(qū)分出不同產(chǎn)品的特征。目前僅國(guó)標(biāo)GB/T 22547-2008規(guī)定了酵母活細(xì)胞數(shù)的顯微檢測(cè)方法——次甲基藍(lán)法，但是對(duì)酵母類的其他產(chǎn)品，比如酵母細(xì)胞壁與酵母水解物，仍沒有鏡檢區(qū)分的標(biāo)準(zhǔn)。由于產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)與其發(fā)揮的生理功能是密不可分的，如果能夠用圖片的形式直觀地說明酵母源產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)，有助于使用者更好地明白酵母類產(chǎn)品的作用機(jī)理，更有針對(duì)性地使用這些產(chǎn)品。在已發(fā)表的文獻(xiàn)中，對(duì)酵母源產(chǎn)品形態(tài)特征方面鮮有論述，因此，有必要開展相關(guān)的研究。

本研究選取了市場(chǎng)上常見的具有代表性的幾種酵母源產(chǎn)品，選擇的依據(jù)主要是應(yīng)用范圍較廣與效果較為明顯的產(chǎn)品種類，共選擇了4種產(chǎn)品，包括酵母水解物、酵母細(xì)胞壁、啤酒酵母粉和活性干酵母。酵母水解物氨基酸和小肽穩(wěn)定且具有高消化率，在動(dòng)物的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)方面具有顯著優(yōu)勢(shì)；酵母細(xì)胞壁作為高效免疫因子，可以直接食用；啤酒酵母粉為傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)飼料；活性干酵母是微生態(tài)制劑中常用的組分。試驗(yàn)的主要目的是通過對(duì)染色方法進(jìn)行改進(jìn)，獲得酵母源產(chǎn)品較為清晰的顯微圖片及掃描電鏡圖片，并拍照記錄。通過對(duì)不同酵母源產(chǎn)品圖片的相互對(duì)比，描述其形態(tài)特征，從而明確區(qū)分不同酵母源產(chǎn)品的生理特性。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1試劑與材料

酵母水解物、啤酒酵母粉、酵母細(xì)胞壁、活性干酵母，均由廣東雅琪生物技術(shù)有限公司微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。酵母水解物為采用糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)后，經(jīng)過自溶、酶解、噴霧干燥等工藝制成的黃色粉狀物，蛋白質(zhì)含量不小于50%，水分含量不大于8.0%；啤酒酵母粉為啤酒酵母酵母泥干燥、粉碎制成的粉狀物，粗蛋白質(zhì)含量為42.8%，水分含量不大于10.0%；將酵母水解物離心分離細(xì)胞內(nèi)容物，留下的細(xì)胞壁經(jīng)過干燥制成酵母細(xì)胞壁多糖，β-葡聚糖含量不小于20%，甘露寡糖含量不小于20%；活性干酵母（飼用高活性干酵母），白色短桿狀，酵母活細(xì)胞數(shù)≥200億個(gè)/g。

蒸餾水，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液 PBS (pH=7.2)，2.5%戊二醛(5 mL 50%濃度的戊二醛，溶于95 mL PBS)，乙醇的梯度水溶液（濃度為30%，50%，70%，80%，90%），乙酸異戊酯，草酸銨結(jié)晶紫染液，碘液，95%酒精溶液，磷鉬酸染液，甲基綠。

1.1.2儀器與設(shè)備

Hitachi S-4800 Field Emission Scanning Electron Microscope掃描電鏡、普通光學(xué)顯微鏡、冷凍干燥機(jī)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1酵母源產(chǎn)品光鏡顯微觀察

（1）取樣品。對(duì)4種酵母源產(chǎn)品進(jìn)行編號(hào)（1~4），每種樣品取1g，3個(gè)重復(fù)，并溶于20 mL蒸餾水中。

（2）制片。制作裝片之前，由于酵母源產(chǎn)品容易沉淀，首先對(duì)樣品進(jìn)行攪拌混勻，再用膠頭滴管取少量樣品滴在玻片上，干燥固定。這一過程結(jié)束后，先對(duì)樣品進(jìn)行一次觀察，并拍照記錄其形態(tài)。

（3）染色。在已經(jīng)固定好的玻片上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液1~2滴，染色1—2 min，水洗，除盡水滴。在玻片上滴加碘液，平放1—3 min，水洗。加95%酒精溶液脫色30—60 s，水洗。再用磷鉬酸染液復(fù)染5 min，用水沖洗后，最后用甲基綠染色1 min，水洗，風(fēng)干后鏡檢^[11]。

（4）對(duì)比不同的試驗(yàn)樣品，分別在不同放大倍數(shù)下進(jìn)行觀察，選擇每組中相對(duì)較為清晰且具有代表性的圖片進(jìn)行拍照記錄。

1.2.2酵母源產(chǎn)品的掃描電鏡觀察

（1）酵母源產(chǎn)品的前處理。①取樣。取0.5 g樣品，溶于10 mL 0.1 mol/L PBS (pH=7.2)，稍攪拌去除上清液，加入等量的PBS清洗三遍，清洗時(shí)每次添加清洗液要充分?jǐn)嚢?，保證菌體與清洗液的充分混合。②固定。2.5%戊二醛(5 mL 50%濃度的戊二醛，溶于95 mL PBS)，4 ℃固定3 h，之后用PBS清洗三次，每次10 min，具體的清洗步驟同①。③梯度脫水。用乙醇的水溶液分別按30%，50%，70%，80%，90%的濃度梯度對(duì)樣品進(jìn)行脫水，每步15 min，之后在100%乙醇的水溶液中脫水2次，每次15 min,再將樣品置于乙醇和乙酸異戊酯1:1混合液中15 min，最后置樣品于乙酸異戊酯中15 min×2次，以徹底去除乙醇，保持細(xì)胞原有形態(tài)（若沒有乙酸異戊酯，可以叔丁醇替代）。④干燥保存。將處理好的樣品傾置于小培養(yǎng)皿中，置-80 ℃冰箱冷凍保存，之后放入冷凍干燥機(jī)中干燥，制成粉末狀，裝袋。

（2）酵母源產(chǎn)品的掃描電鏡觀察。

用Hitachi S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡對(duì)樣品進(jìn)行亞顯微觀察。樣品按照該掃描電鏡的操作規(guī)范進(jìn)行處理。首先將經(jīng)過預(yù)處理的樣品（呈粉末狀）撒到導(dǎo)電膠上，用吸耳球或高壓氮?dú)獯祾叩魧?dǎo)電膠上未粘緊的樣品粉末。固定好后，對(duì)樣品進(jìn)行噴金處理，使導(dǎo)電，再將制備好的樣品放到樣品室進(jìn)行觀察，樣品室真空度小于 E-3 Pa。設(shè)定合適的加速高壓和發(fā)射電流。發(fā)射電流設(shè)為10 μA。選擇圖形信號(hào)及探測(cè)器類型為BSE，高度Z為5 mm。加高壓后對(duì)中并聚焦，在電腦顯示屏上即獲得顯微圖像。對(duì)整個(gè)酵母產(chǎn)品樣品表面進(jìn)行觀察，掃描速度設(shè)定為Slow 3，選擇具有代表性的區(qū)域進(jìn)行拍攝，并且在不同放大倍數(shù)下進(jìn)行拍攝，以利于后期的圖片對(duì)比觀察。

2試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1酵母源產(chǎn)品顯微圖片及分析

2.1.1 酵母源產(chǎn)品的直接光學(xué)顯微鏡觀察

就酵母的直接顯微觀察而言，圖1可見啤酒酵母粉能觀察到完整的酵母細(xì)胞，細(xì)胞呈分散狀，輪廓較為分明，能看到細(xì)胞壁、液泡等結(jié)構(gòu)（圖1，黑色箭頭示）。對(duì)于酵母細(xì)胞壁產(chǎn)品（圖2），許多酵母細(xì)胞會(huì)傾向于粘結(jié)在一起呈團(tuán)狀，幾乎無(wú)法看到完整細(xì)胞之間的界限。

由圖3活性干酵母和圖4酵母水解物對(duì)比觀察到，兩者酵母細(xì)胞基本保持了完整形態(tài)?；钚愿山湍讣?xì)胞外表有光澤，形態(tài)飽滿，不透明，呈淡綠色。而酵母水解物個(gè)體明顯偏大，變薄，透光性高，顏色暗淡，可清晰看到酵母細(xì)胞內(nèi)呈黑點(diǎn)狀的貯藏顆粒（圖4）。

2.1.2 酵母源產(chǎn)品的改良革蘭氏染色觀察

就酵母源產(chǎn)品的改良革蘭氏染色觀察而言，圖5顯示啤酒酵母粉的細(xì)胞溶解破裂，里面的內(nèi)容物（淺藍(lán)色物質(zhì)）析出（黑箭頭示）。而使用染色方法可以非常容易地區(qū)分出破裂的細(xì)胞壁組分（圖6，黑箭頭示圍繞在酵母細(xì)胞外的細(xì)胞壁組分）。酵母水解物細(xì)胞在顯微鏡下顯示淺綠色，透明，貯藏顆粒在細(xì)胞內(nèi)呈黑點(diǎn)狀（圖8）。而活性干酵母細(xì)胞染色后呈深藍(lán)色（圖7），內(nèi)部組織無(wú)法看清。

2.2酵母源產(chǎn)品的掃描電鏡圖片及分析

從酵母源產(chǎn)品的掃描電鏡可以看出，對(duì)于酵母水解物，可見細(xì)胞膜破裂溶解，顯露細(xì)胞內(nèi)容物（圖9，白箭頭示）。而對(duì)于啤酒酵母細(xì)胞壁，則可見大量細(xì)胞壁成分堆疊在一起，酵母細(xì)胞僅剩下一個(gè)個(gè)變形的空殼，偶見一兩個(gè)略為完整的酵母細(xì)胞（圖10，白箭頭示）。就細(xì)胞形態(tài)而言，普通啤酒酵母粉細(xì)胞表面特征和活性干酵母差別不大（圖11，圖12），但是活性酵母細(xì)胞大小僅約4 μm，而啤酒酵母粉酵母細(xì)胞直徑約8~10 μm，差異明顯。兩種產(chǎn)品酵母細(xì)胞均有形成芽體的個(gè)體。　

3 討論

盡管酵母菌在自然界中存在的種類較多，但是在動(dòng)物飼料領(lǐng)域?qū)嶋H利用開發(fā)的種類并不多。列入農(nóng)業(yè)部最近三年發(fā)布的《飼料原料目錄》、《飼料原料目錄》修訂列表、《飼料添加劑品種目錄》飼料原料及添加劑目錄中的酵母源產(chǎn)品有：啤酒酵母粉、啤酒酵母泥、產(chǎn)朊假絲酵母蛋白、食用酵母、釀酒酵母水解物、釀酒酵母細(xì)胞壁、釀酒酵母提取物、釀酒酵母培養(yǎng)物、產(chǎn)朊假絲酵母和釀酒酵母。目前活性干酵母、啤酒酵母粉、酵母細(xì)胞壁等產(chǎn)品市場(chǎng)接納度相對(duì)較廣，使用也相對(duì)較多。本研究證實(shí)，這些產(chǎn)品能都擁有其較典型的形態(tài)特征，可在顯微鏡下辨別出來。

從形態(tài)觀察來看，簡(jiǎn)單的用蒸餾水稀釋，可直接在顯微鏡下觀察出活性干酵母與啤酒酵母粉的細(xì)胞形態(tài)?；钚愿山湍革@得特別飽滿，外表有光澤，這也是酵母細(xì)胞的原本生物形態(tài)（圖3）；而啤酒酵母粉細(xì)胞喪失光澤，明顯干癟，透性增大（圖4）。這會(huì)是區(qū)分兩者的主要方法。這些形態(tài)特征也與它們?cè)趧?dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的主要功能——改善腸道環(huán)境和作為蛋白源物質(zhì)密切相關(guān)的。當(dāng)然活性干酵母本身也可作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，已有大量的研究顯示，活性酵母能提高斷奶仔豬生產(chǎn)性能和免疫功能，改善奶牛瘤胃體外發(fā)酵特性，而啤酒酵母粉用于大菱鲆幼魚的飼養(yǎng)，可替代達(dá)17%的魚粉^[12-15]。

使用改良的革蘭氏染色方法，將革蘭氏染液第4液的稀釋沙黃液改為磷鉬酸液和甲基綠液，復(fù)染后酵母菌細(xì)胞壁被染成深綠色，細(xì)胞漿為藍(lán)紫色，在顯微鏡下易與其他成份區(qū)別。使用這種方法，對(duì)于酵母水解物與酵母細(xì)胞壁成分區(qū)別明顯，酵母水解物滲出的細(xì)胞內(nèi)容物、細(xì)胞壁碎片清晰可辨（圖5，圖6）。到了掃描電鏡的放大倍數(shù)，這種區(qū)別更為明顯。酵母水解物可見細(xì)胞膜破裂溶解，顯露細(xì)胞內(nèi)容物（圖9）。在這種情況下，動(dòng)物分泌的消化酶能更容易地接觸酵母內(nèi)部的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，消化吸收率得到提高。在生產(chǎn)實(shí)踐上，酵母水解物可替代血漿蛋白粉在斷奶仔豬上使用^[16]，提高7~63日齡仔豬的日增重量^[17]。并且替代飼料中的魚粉可以提高凡納濱對(duì)蝦對(duì)飼料的消化機(jī)能^[18]。

而對(duì)于啤酒酵母細(xì)胞壁，則可見大量細(xì)胞壁成分堆疊在一起，酵母細(xì)胞僅剩下一個(gè)個(gè)變形的空殼（圖10），在普通光學(xué)顯微鏡下為成塊狀的細(xì)胞碎片結(jié)構(gòu)（圖2，圖6）。這些散亂的細(xì)胞壁碎片，充當(dāng)著信號(hào)分子的作用，被動(dòng)物免疫細(xì)胞識(shí)別后，能很好地提升整個(gè)機(jī)體的免疫水平。啤酒酵母細(xì)胞壁作為一種免疫增強(qiáng)劑在母豬、蛋雞、異育銀鯽養(yǎng)殖上均有積極的效果^[19-21]。

本文所采用的4種實(shí)驗(yàn)材料，均來自在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)一線的商業(yè)化產(chǎn)品，這些產(chǎn)品有多年的市場(chǎng)應(yīng)用實(shí)踐，能夠在一定程度上反映出市場(chǎng)上主流的酵母源生物飼料概況。由于在現(xiàn)實(shí)中尚無(wú)酵母源飼料的所謂“標(biāo)準(zhǔn)參考產(chǎn)品”（盡管酵母菌作為模式種對(duì)其形態(tài)特征已了解相對(duì)清楚），以這些試驗(yàn)材料作為論述酵母源飼料的典型特征，可能不夠恰當(dāng)。事實(shí)上關(guān)于酵母及其衍生物典型特征的報(bào)道非常少，商業(yè)市場(chǎng)仍處于初級(jí)階段，大多數(shù)從業(yè)者了解仍不透徹。

再?gòu)纳a(chǎn)工藝上看，在制備酵母細(xì)胞壁成分時(shí)，需首先通過酶法或自溶法將酵母細(xì)胞破壁水解，再通過高速離心分離細(xì)胞內(nèi)容物（這些細(xì)胞內(nèi)容物經(jīng)噴霧干燥后成為酵母精），即獲得細(xì)胞壁成分 ^[22]。因此從這個(gè)意義上說，細(xì)胞壁產(chǎn)品為酵母水解物的深加工產(chǎn)品。工業(yè)化的高速離心手段很難將體系中懸浮的所有酵母細(xì)胞都除去，因此造成了用普通光學(xué)顯微鏡觀察不同酵母組分產(chǎn)品時(shí)都能看到完整的酵母細(xì)胞。

因此，在判斷這些產(chǎn)品的質(zhì)量時(shí)，不能僅依賴顯微鏡觀察，而應(yīng)充分考慮其理化指標(biāo)。比如，對(duì)于酵母水解物，粗蛋白質(zhì)、氨基酸態(tài)氮、甘露聚糖和水分等是其強(qiáng)制性標(biāo)識(shí)要求。而對(duì)于釀酒酵母細(xì)胞壁，甘露聚糖和水分是其強(qiáng)制性標(biāo)識(shí)要求。消費(fèi)者與企業(yè)質(zhì)檢部門均需全面考慮以判斷產(chǎn)品質(zhì)量。

目前我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告中允許使用的酵母類產(chǎn)品大部分都集中在釀酒酵母屬的種類，總體而言精細(xì)化加工程度是不高的，酵母類產(chǎn)品在農(nóng)牧業(yè)的市場(chǎng)前景將非常廣闊，值得進(jìn)一步工業(yè)化研究。

4 結(jié)論

（1）應(yīng)用不同的染色方法和技術(shù)手段，在顯微鏡下區(qū)分出酵母水解物、酵母細(xì)胞壁、啤酒酵母粉（烘干）和活性干酵母這4種酵母源飼料產(chǎn)品是可行的。這4種產(chǎn)品均有各自明顯的形態(tài)特征，這些形態(tài)特征與其發(fā)揮的生理功能是密不可分的。

（2）在判斷酵母源產(chǎn)品的質(zhì)量時(shí)，僅依賴顯微鏡觀察是不夠的，需根據(jù)不同產(chǎn)品，結(jié)合其不同的理化指標(biāo)全面考慮。